EMSA实验步骤
1. 蛋白提取
按照核蛋白和胞浆蛋白提取试剂盒说明书操作步骤提取核蛋白。
2. 蛋白浓度定量
使用BCA蛋白质浓度测定试剂盒测定样品蛋白浓度。
3. 制胶 （1mm胶，大约5分钟胶会凝）
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试剂 |
浓度6.5％ |
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H2O ml |
6.8 |
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5*TBE ml |
1 |
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40％丙烯酰胺（37.5：1）ml |
1.65 |
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50%甘油 ul |
500 |
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10％AP ul |
100 |
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TEMED ul |
10 |
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总体积ml |
10 |
待胶完全凝固后100v预电泳1h，缓冲液用预冷的0.5×TBE。
4. 蛋白与探针反应
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体积 |
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10×binding buffer |
2ul |
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1ul |
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50％glycerol |
1ul |
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1%NP-40 |
1ul |
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100m M Mgcl2 |
1ul |
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核蛋白（unit） |
阴性对照反应：0 阳性对照反应：1 冷探针竞争反应：1 常规反应：1 |
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DNA(pmol/ul) |
阴性对照反应：0ul 阳性对照反应：0ul 冷探针竞争反应：1ul 常规反应：0ul |
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BIO-DNA(fmol/ul) |
阴性对照反应：1ul 阳性对照反应：1ul 冷探针竞争反应：1ul 常规反应：1ul |
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总体积 |
ddH2O补足至20ul |
混合后室温放置20分钟或以上。
5. 上样
预电泳完后更换预冷的电泳缓冲液，加5ul的5×上样缓冲液到样品混合液中，马上上样电泳。150v 30－45分钟。
6. 电转移
将带正电的尼龙膜放入0.5×TBE中平衡10分钟。待电泳完成后将加有样品的整块胶取下电转。转膜缓冲液为预冷的0.5×TBE。380m A 30分钟。
7. 交联
转膜完成后将膜取出，放在一张干净的滤纸上，做好标记。于紫外交联仪下交联10min。
8. 封闭
用封闭液封闭15分钟。期间放于摇床上轻柔摇晃。
9. 抗体反应
倒掉封闭液。用封闭液将抗体稀释300倍后，与膜完全作用15分钟。期间放于摇床轻柔摇晃。
10. 洗脱
用1×的洗脱液清洗5分钟4次。
11. 平衡
用平衡液平衡5分钟。
12. ECL发光检测。
1）滴加新鲜配制的ECL混合溶液到膜的蛋白面侧，暗室中曝光。
2）根据不同的光强度调整曝光条件，显影、定影。
13. 结果分析
将胶片进行扫描存档，AlphaEaseFC软件处理系统分析目标带的光密度值。
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