实验技术服务

免疫共沉淀(Co-IP)实验步骤

1、蛋白提取

1）贴壁细胞总蛋白提取：

用PBS缓冲液润洗贴壁细胞2-3次，最后一次尽量吸干残留液。加入适当体积的IP裂解液（使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂）于培养板/瓶内裂解3-5min。期间反复晃动培养板/瓶，使试剂与细胞充分接触。用细胞刮刀将细胞及试剂刮下，收集到1.5mL离心管中。冰浴30min，期间用移液器反复吹打，确保细胞完全裂解。4℃12000rpm离心5min，收集上清，取上清1/10作为Input，剩余样本做IP。

2）悬浮细胞总蛋白提取：

低速离心收集细胞，加入适当体积的冷却的PBS缓冲液重悬，2000rpm离心10 min，吸除上清。重复以上操作两次，收集细胞沉淀。加入适当体积的IP裂解液（使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂），振荡。冰浴30min，期间用移液器反复吹打，确保细胞完全裂解。4℃12000rpm离心5min，收集上清，取上清1/10作为Input，剩余样本做IP。

3）组织总蛋白提取：

组织块用预冷的PBS缓冲液漂洗2-3次，去除血污，剪成小块置于匀浆器中。加入10倍于组织体积的IP裂解液（使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂），冰浴彻底匀浆。将匀浆液转移至离心管中，振荡。冰浴30min，期间用移液器反复吹打，确保匀浆液完全裂解。4℃12000rpm离心5min，收集上清，取上清1/10作为Input，剩余样本做IP。

2、蛋白浓度定量

使用BCA蛋白质浓度测定试剂盒测定样品蛋白浓度。

3、磁珠预处理

取20μl磁珠加入适当体积的IP裂解液于离心管中，置于垂直摇床上洗涤5min后，将离心管置于磁力架上静置5-10s,吸掉上清（尽量避免碰到磁珠）。

4、裂解液预处理

向细胞裂解液上清或者组织裂解上清中加入1.0μg IgG（与COIP实验用于沉淀的抗体种属来源相同的普通IgG）和20μl磁珠（使用前充分混匀），4℃摇转孵育30min。

5、IP过程

① 取以上相同量细胞裂解液或者组织裂解液上清1到1.5ml离心管中，加入1-10μL（0.2-2μg）抗体沉淀两种相互作用的蛋白质中的一种（同时加相同量的与用于沉淀的抗体种属来源相同的普通IgG作为阴性对照，阴性对照实验），然后4℃孵育1h；（一般加入1.0μg沉淀抗体，具体沉淀抗体加入量根据IP级抗体使用说明书进行稀释）。

② 再加入20μl磁珠（使用前充分混匀），用手指轻轻弹匀，4℃摇转孵育过夜；

③ 将离心管置于磁力架上静置5-10s,吸掉上清（尽量避免碰到磁珠）。

④ 加入适当体积的Washing buffer于离心管中，置于垂直摇床上洗涤3min后，将离心管置于磁力架上静置5-10s,吸掉上清（尽量避免碰到磁珠）。

⑤ 重复④操作3次。

⑥ 最后一次洗涤之后，小心弃去上清后，加入适当体积2×SDS含巯基乙醇的上样缓冲液，沸水煮10min，样本置于-20℃保存。

6、SDS-PAGE电泳

制胶与上样

①配制分离胶（见附录1），加入TEMED后立即摇匀灌胶。在胶面上缓慢加入适量水以压平胶面，约45min后倒去胶上层水并用吸水纸将剩余水吸干。

②配制浓缩胶（见附录2），加入TEMED后立即摇匀灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。

③拔出梳子，将电泳架放入电泳槽中，加入电泳缓冲液，将样品加入点样孔中。

④按浓缩胶80V、分离胶120V进行恒压电泳，至溴酚蓝到达胶板下沿。

7、转膜

1）准备转膜滤纸和PVDF膜，PVDF膜在使用之前先用甲醇活化。

2）按照正负极的方向摆放转膜“三明治”结构，从正极到负极依次为转膜海绵、3层滤纸、PVDF膜、胶、3层滤纸、转膜海绵，摆放过程中要除尽各层中气泡。

3）按300mA恒流转膜，转膜时间根据目的蛋白分子量大小调整。

8、抗体孵育

1）将转好的膜加入封闭液室温封闭1h。

2）除去封闭液，加入已稀释好的一抗4℃过夜。

3）回收已稀释的一抗，用TBST洗三次，每次5min

4）加入稀释好的二抗，室温孵育30min，用TBST在室温下摇床上洗四次，每次5min。

9、化学发光检测

1）滴加新鲜配制的ECL混合溶液到膜的蛋白面侧，暗室中曝光。

2）根据不同的光强度调整曝光条件，显影、定影。

10、结果分析

将胶片进行扫描存档，AlphaEaseFC软件处理系统分析目标带的光密度值。