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Tunel细胞凋亡检测实验步骤

1.         依次将切片放入二甲苯Ⅰ20min-二甲苯Ⅱ20min-无水乙醇Ⅰ10min-无水乙醇Ⅱ10min-95%酒精5min-90%酒精5min-80%酒精5min-70%酒精5min-蒸馏水洗。

2.         切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈（防止液体流走），在圈内滴加蛋白酶K工作液覆盖组织，37℃孵育15min。将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。

3.         切片稍甩干后在圈内滴加破膜工作液覆盖组织，常温下孵育10min，将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。

4.         按片子数量和组织大小取tunel试剂盒内适量试剂1(TdT)和试剂2(dUTP)按1:9混合，加到圈内覆盖组织，切片平放于湿盒内，37℃水浴锅孵育60min，湿盒内加少量水保持湿度。

5.         将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片放入用甲醇配制的3%过氧化氢溶液，室温避光孵育20 min，将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。

6.         切片稍甩干后，每张切片加适量试剂3(converter-POD）覆盖组织，切片平放于湿盒内，37℃孵育30min。将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。

7.         切片稍甩干后在圈内滴加新鲜配制的DAB显色液，显微镜下控制显色时间，细胞核显色棕黄色为阳性，显色适度后PBS（PH7.4）冲洗切片终止显色。

8.         显色完全后，蒸馏水或自来水冲洗，苏木素复染，1%盐酸酒精分化（约1s），自来水冲洗，氨水返蓝，流水冲洗

9.         将切片依次放入70%酒精5min-80%酒精5min -90%酒精5min -95%酒精5min -无水乙醇Ⅰ5min -无水乙醇Ⅱ5min -二甲苯Ⅰ5min -二甲苯Ⅱ5min中脱水透明，将切片从二甲苯拿出来稍晾干，中性树胶封片。