实验技术服务

甲基化检测（msp）实验检测

1、DNA提取

（1）于液氮中取组织约100mg，用已消毒的剪刀将组织剪碎，放入标记好的1.5mL EP管中，加入300μL TNES Buffer，涡旋混匀，加入10μL RNase A/T1 Mix，室温静置5min，加入20μL 蛋白酶K，37℃水浴过夜。

（2）加入1/4体积饱和NaCl溶液，颠倒混匀，涡旋30s。室温，14000rpm，20min。

（3）取上清于一新1.5mL EP管中，加入1/2体积Tris-饱和酚，1/2体积三氯甲烷，涡旋1min。室温，14000rpm，20min。

（4）弃上清，加入1mL无水乙醇，颠倒混匀，涡旋30s。室温，14000rpm，5min。

（5）弃上清，1mL 70%乙醇洗涤沉淀。室温，14000rpm，5min。

（6）弃上清，室温风干酒精。加入50μL TE Buffer，55℃水浴20min，溶解DNA。-20℃保存。

2、重亚硫酸盐处理DNA（ZYMO ：Methylation-Gold Kit，货号：D5005S）

重亚硫酸盐DNA甲基化采用Methylation-Gold Kit试剂盒进行（ZYMO公司），主要步骤如下：

（1）取20 μL基因组DNA（500 pg-2 μg）样品于PCR管中，加入130 μL CT转换试剂，振荡混匀。

（2）将PCR管放入PCR仪中，98℃，10 min；64℃，2.5 h；4℃，放置20 h。

（3）加入600 μL M-Binding缓冲液到Zymo-Spin吸附柱中，将吸附柱放回收集管中。

（4）将2）中的样品加到3）中的Zymo-Spin吸附柱里，颠倒混匀。

（5）12000 g离心30s，倒掉废液，将吸附柱放回收集管中。

（6）向吸附柱中加入100 μL M-Wash缓冲液（已加入无水乙醇），12000 g离心30s，倒掉废液，将吸附柱放回收集管中。

（7）向吸附柱中加入200 μL M-Desulphonation缓冲液，室温静置15-20 min，12000 g离心30s，倒掉废液，将吸附柱放回收集管中。

（8）向吸附柱中加入200 μL M-Wash缓冲液，12000 g离心30s，倒掉废液。重复一次。

（9）将吸附柱转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加20μL M-Elution缓冲液，室温放置5min，12000 g离心30s，将溶液收集到离心管中。

3、PCR扩增及凝胶电泳

（1）取0.2ml PCR管，配制如下反应体系。

试剂	使用量
2×HieffTM PCR Master Mix	10.0 μL
10μM上游基因引物	1.0 μL
10μM下游基因引物	1.0 μL
基因组DNA	2.0 μL
ddH2O	up to 20.0 μL

 

（2）PCR扩增程序：预变性                                    98℃，4min

变性                                  98℃，30s      

退火                                  56℃，30s    40 cycles

延伸                                  72℃，30s                

末段延伸                              72℃，10min

 

（3）凝胶制备及电泳：① 50*TAE，纯水配成1*TAE工作液（980mL纯水+20mL 50*TAE）。

                     ② 称取2g西班牙琼脂糖，加100mL 1*TAE工作液，微波溶解，制成2%琼脂糖凝胶，冷却至60℃，加入10μL GoldView I型核酸染色剂，混匀倒入槽中。

                     ③ 拔梳，加入10μL PCR产物（with Dye）。

                     ④ 电压120V，25min，紫外仪下观察并拍照。